Технология elispot что это
Технология elispot что это
Тест предназначен для оценки Т-клеточного иммунитета к СOVID-19. Позволяет выявить в крови специфические Т-клетки (Т-лимфоциты), реагирующие на определенные антигены коронавируса SARS-CoV-2. Такие специфические Т-лимфоциты способны узнавать и уничтожать пораженные вирусом клетки и могут потенциально обеспечивать долгосрочную защиту от COVID-19, в том числе при отсутствии антител. Оценка Т-клеточного иммунитета наряду с гуморальным (определение антител) может использоваться как дополнительный маркер иммунной защиты от COVID-19.
Используется технология ELISPOT, которая является наиболее перспективной на сегодняшний день платформой для оценки Т-клеточного иммунитета.
Синонимы русские
Т-клети, Т-лимфоциты к коронавирусу.
Синонимы английские
T-cell immunity to COVID-19.
Прямая оценка функции Т-клеток ELISPOT.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Специальной подготовки не требуется.
Общая информация об исследовании
Пандемия SARS-CoV-2 привела к гибели более 2 миллионов человек на сегодняшний день, и существует острая потребность в эффективной вакцине. Есть значительный интерес к пониманию того, насколько адаптивные иммунные реакции контролируют острую инфекцию и обеспечивают защиту от повторного заражения.
Антительные ответы против SARS-CoV-2 характеризуются реакцией против ряда вирусных белков, включая спайковые белки, нуклеопротеины и мембранные белки. Уровни антител снижаются после избавления от первичной инфекции, и в настоящее время актуален вопрос о поддержании гуморальных ответов в долгосрочной перспективе. Хотя первоначальные анализы показали потерю выявляемых вирус-специфических антител у части людей, высокочувствительный ИФА может определять обнаруживаемые антитела в течение как минимум 6-7 месяцев у большинства людей. Данные, полученные в результате исследования иммунитета к родственным вирусам, таким как SARS-CoV-1 и ближневосточный респираторный синдром, свидетельствуют о том, что клеточные иммунные ответы против этих вирусов поддерживаются в течение более длительных периодов по сравнению с ответами антител. Это позволяет надеяться, что клеточные реакции на SARS-CoV-2 также будут более продолжительными. На сегодняшний день исследования показали, что вирус-специфические клеточные реакции развиваются практически у всех пациентов с подтвержденной инфекцией SARS-CoV-2.
Величина и качество ответа иммунной памяти к SARS-CoV-2 будет иметь решающее значение для предотвращения повторного заражения.
Величина ответа Т-клеток является неоднородной и может отражать разнообразие профиля Т-клеточного иммунитета во время острого инфекционного заболевания. Важной особенностью является то, что величина клеточного иммунитета по данным ELISPOT на 50 % выше у доноров, перенесших симптомную инфекцию. Это демонстрирует, что первоначальная «контрольная точка» клеточного иммунитета, выработанная после острой инфекции, сохраняется не менее 6 месяцев. Клеточные ответы имеют прямую защитную способность от тяжелой коронавирусной инфекции, а также поддерживают выработку антител.
Исследования показывают, что устойчивый клеточный иммунитет против SARS-CoV-2 может присутствовать в подавляющем большинстве случаев у взрослых через 6 месяцев после бессимптомной инфекции или легкой и средней степени тяжести инфекционного заболевания. Эти особенности обнадеживают в отношении длительности клеточного иммунитета против этого нового вируса и, вероятно, способствуют относительно низкому риску повторного заражения.
Анализ на Т-клеточный иммунитет проводится методом ELISPOT, который имеет ряд преимуществ:
проверенная технология обнаружения активных Т-клеток для измерения силы иммунного ответа на инфекцию;
технология ELISPOT в настоящее время является уникальной в мире;
ELISPOT широко используется исследователями разных стран при разработке вакцин от COVID-19;
ELISPOT является наиболее перспективной платформой среди методов оценки Т-клеточного иммунного ответа:
к определенным Т-лимфоцитам добавляют белки вируса;
если Т-лимфоциты и вирусы раньше встречались, то они выделяют цитокины;
если спотов больше 12 – это означает, что иммунитет есть.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Панель антигенов 1 (пептиды белка S), SPOT:
Панель антигенов 2 (пептиды белков N, M, O3, O7), SPOT:
положительный результат может потенциально свидетельствовать о перенесенной или текущей инфекции COVID-19, в том числе бессимптомно, и о сформировавшемся Т-клеточном иммунном ответе к вирусу SARS-CoV-2.
У большинства переболевших, у которых не выявляются антитела, есть Т-клеточный ответ. Люди без антител, контактировавшие с больными и не заболевшие, также в большинстве своем имеют Т-лимфоциты.
Кто назначает исследование?
Терапевт, врач общей практики.
#1 Сообщение Anton » Сб янв 05, 2019 12:48 pm
ELISPOT более чувствительный и более точный анализ крови на инфекции, чем ИФА.
Для диагностики методом ELISPOT сдается кровь из вены.
ELISPOT на выявление Chlamydia trachomatis на сегодня в России и странах СНГ не делают.
На сегодня ELISPOT на Chlamydia trachomatis можно сделать в Германии в лаборатории ArminLabs. https://www.arminlabs.com/ru [https://www.arminlabs.com/ru]
Но для проведения анализа крови на Chlamydia trachomatis (также и на другие инфекции) методом ELISPOT в данной лаборатории можно сдать кровь в России (либо в другой стране СНГ, не только в Украине и Беларуси) и отправить её в данную лабораторию специальной курьерской службой. В некоторых городах есть пункты забора крови, откуда и отправляют её в данную лабораторию.
В Москве, Ростове-на-дону и Екатеринбурге имеются пункты забора крови, в которые можно придти и сдать кровь для анализов по записи без заказа курьера.
Из других городов России отправка осуществляется при помощи курьерской службы.
Информация по сдаче, оплате и отправки крови на анализ в Германию в лабораторию ArminLabs из России:
Информация по сдаче, оплате и отправки крови на анализ в Германию в лабораторию ArminLabs из Украины:
Активные ссылки видны заргеистрированным пользователям.
Данная информация с форума по Беррелиозу, там обсуждается диагностика Боррелиоза в лаборатории ArminLabs методом ELISPOT. Но как выяснилось данная лаборатория делает этим же методом и анализ на Chlamydia trachomatis.
Информация предварительная, все подробности нужно уточнять.
#2 Сообщение Anton » Сб янв 05, 2019 12:55 pm
Контактная информация взята с форума по Боррелиозу.
Активные ссылки видны зарегистрированным пользователям.
#3 Сообщение Anton » Сб янв 05, 2019 1:40 pm
Информация по оформлению и оплате анализов из Беларуссии: уточняйте условия выполнения по телефону в России +7 499 403 17 69
#4 Сообщение 708plan708 » Сб янв 05, 2019 6:22 pm
#5 Сообщение Anton » Пн янв 07, 2019 8:49 am
Доставка в основном осуществляется курьерской международной службой DHL.
Стоимость доставки крови в лабораторию 10 000 руб / Rus
Стоимость самих анализов методом ELISPOT в лаборатории ArminLabs (Германия):
Chlamydia trachomatis 69 €
Итого: 15 500 руб / Rus по текущему курсу.
#6 Сообщение Anton » Пн янв 07, 2019 10:35 am
#7 Сообщение Anton » Пн янв 07, 2019 10:47 am
#8 Сообщение Anton » Пн янв 07, 2019 10:55 am
#9 Сообщение 708plan708 » Пн янв 07, 2019 1:39 pm
#10 Сообщение harper » Пн янв 21, 2019 12:23 pm
#11 Сообщение Anton » Пн янв 21, 2019 12:35 pm
Рузультат слабоПоложительно. Т.е. у тебя не 0-1, т.е. не отрицательно, а положительно, но слабо.
Думаю хлам есть и по всей видимости в хрони, раз низкая клетончая активность к нему, наверное давно сидит. Я думаю тебе нужно написать в АрминЛабс, приложить свой результат и спросить о чем говорит данный результат, т.е. попросить, чтобы интерпретировали результат анализа.
Большая просьба к тебе описать подробно как ты всё это дело сдавал, куда как обращался, во сколько всё это обошлось, т.е. описать весь процесс взаимодействия от начала взаимодействия, до получения результата.
#12 Сообщение harper » Пн янв 21, 2019 7:08 pm
1) на сайте: https://order.manumedix.com/ выбираем в разделе анализы интересующие нас.
2) оплачиваем карточкой, вводим данные, на почту приходит подтверждение
3) далее вам звонят, уточняют детали и сообщают, что нужно будет еще за пересылку в Германию доплатить 10 000 руб. (на самом деле все это можно узнать еще до оплаты карточкой по телефону).
Для указанного анализа нужно сдать кровь. Сдать ее можно либо в Москве (с понедельника по среду по предварительной записи), либо в любом другом городе. В последнем случае, как я понял, вам высылают пробирки, вы на месте договариваетесь с местной частной лабораторией типа хеликса или инвитро, что у вас в эти пробирки возьмут кровь, после чего вы их запечатываете, к вам приезжает курьер DHL и все это дело отправляется в Германию.
4) вас предварительно записывают, если сдаете в Москве, с собой нужно взять распечатанный и подписанный бланк. Приходишь, сдаешь, все отправляют в Германию
5) результаты приходят на электронную почту достаточно быстро. Мне пришли где-то через 5 дней после сдачи.
#13 Сообщение Gleb270683 » Вт янв 22, 2019 6:35 am
#14 Сообщение Anton » Вт янв 22, 2019 10:19 am
#15 Сообщение Anton » Вт янв 22, 2019 11:34 am
Точность здесь в том, что если результат > 3, то это инфекция 100% есть!
Альтернативные методы по крови, к примеру ИФА дают не точный результат, т.е. если у человека в результате ИФА покажет только IgG, да еще и в низких титрах, да даже если и в высоких, то здесь бабка на двое сказал, т.е. достоверно точно не понятно то ли это говорит о том, что инфекция точно есть, то ли о том, что она была и это маркер перенесенной инфекции.
Даже когда по ИФА при выявлены титры IgA и IgM врачи не берутся точно говорить есть ли инфекция или нет, тем более когда титры низкие, а в хрони они либо низкие, либо вообще на нуле. Но для меня, по крайней мере, наличие IgA и/или IgM даже в низких титрах при наличии симптом говорит о том, что инфекция точно есть, и даже если выявлен только IgG и если даже в низких титрах. Т.е. если инфекция давняя, есть симптомы, то IgG в низких титрах может указывать на её присутствии. IgG это маркер не только перенесенной когда-то инфекции, но и маркер хронической инфекции.
Если с ИФА столько всяких нюансов и непоняток, то с ELISPOT всё гораздо понятнее. В ELISPOT не 3 маркера (IgA, IgM, IgG) как у ИФА, у которых еще и тритры нужно как то трактовать и то с определенной вероятностью. У ELISPOT всего 1 маркер, титры у него тоже есть и трактовка его во много раз более точная, чем у ИФА, по крайней мере в случае уровня титра > 3. Т.е. если титр ELISPOT > 3, то результат считается положительным, в таком случае считается, что инфекция 100% есть! В то время как положительный результат ИФА по мнению официальной медицины говорит только о том, что антитела к инфекции есть, а не о том, что инфекция присутсвует, т.е. по поводу результата ИФА бабка на двое сказал, т.е. то ли есть инфекция, то ли была инфекция, в то время как ответ ELISPOT более категоричен, по крайней мере в случае, когда его титр > 3, то со 100% уверенностью можно заявлять, что инфекция точно есть! Именно это и делает ELISPOT высокоточным (категоричным) методом, по крайней мере по показателю «> 3», при котором 100% можно быть уверенным в отличии вероятностных предположительных трактовок по поводу результатов ИФА.
В этом контексте более точных и категоричных в этом плане методов выявления инфекций по крови чем ELISPOT на сегодня нет. По крайней мере мне такие не известны.
Есть конечно недостаток и у ELISPOT, когда в результате указано «2-3» при котором результат считается слабоположительным. Здесь конечно нет уверенности, что инфекция есть. Но если учесть, что отрицательный результат ELISPOT это когда его титры «0-1», а у тебя результат «2», который считается слабоПоложительным, но если есть симптомы и результат хоть и слабо но положительный, то я бы со 100% был уверен, что инфекция есть. А когда результат «> 3», то и для официальной медицины это аргумент в пользу 100% присутствия инфекции и назначения соответствующего лечения, по крайней мере для западной медицины, которая широко применяет в выявлении инфекций метод ELISPOT и на основе него ставит диагнозы и назначает лечение.
#16 Сообщение fics1 » Вт янв 22, 2019 5:51 pm
Я знаю человека у которого ИФА в сетевых лабораториях на отечественных тест системах отрицательные, а элисопт показал значение 40, здесь уже и гадать не нужно.
Сам сдавал, результат 1. Сдавал по описанному выше алгоритму.
#17 Сообщение harper » Вт янв 22, 2019 7:13 pm
Оценка Т-клеточного ответа на вирус SARS-CoV-2 методом ELISPOT
Т-клетки начинают вырабатываться организмом раньше, чем антитела. Именно так называемая Т-клетка хэлпер подает сигнал организму для выработки антител. Т-клетка памяти отвечает за длительную защиту от инфекции. Т-клетка киллер атакует клетки, пораженные вирусом, и уничтожает их.
Определение Т-клеточного иммунитета может использоваться как дополнительный маркер комплексной оценки иммунной защиты организма.
Для чего проводится исследование Т-клеточного ответа?
Коронавирус SARS-CoV-2 имеет огромное разнообразие клинических проявлений: от абсолютно бессимптомных форм до развернутой клинической картины с масштабным поражением внутренних органов вплоть до летального исхода. Степень иммунной защиты организма может быть определяющим фактором в понимании особенностей течения заболевания у того или иного человека.
Для того, чтобы полноценно оценить иммунную защиту, необходимо провести комплексное исследование гуморального иммунитета (AgG, AgM) и Т-клеточного иммунитета.
Проведение исследования Т-клеточного иммунитета рекомендовано:
Методика тестирования: технология ELISPOT
Технология ELISPOT – это уникальная методика, зарекомендовавшая себя для определения силы иммунного ответа на инфекцию. Метод показал высокую эффективность при диагностике скрытого туберкулеза, впервые в мире его широко применила английская компания Oxford Immunoteс. В настоящее время технология ELISPOT применяется исследователями по всему миру при разработке вакцин от SARS-CoV-2. Именно эта платформа оценивается как наиболее перспективная из методов оценки Т-клеточного иммунитета.
Где пройти оценку Т-клеточного иммунитета от SARS—CoV-2 в Москве?
Вы можете сдать кровь на исследование в ИДВНЭ имени Святителя Луки (ул. Академика Анохина, д.9). Предварительная запись не требуется, часы работы процедурного кабинета с 8.00 до 14.00. Предварительная подготовка: натощак (не менее 8 часов голода, пить можно только простую воду), не курить за 2 часа до забора крови.
ELISPOT
В диагностике боррелиоза, наряду с определением специфического гуморального иммунитета (анализы на антитела), используют анализ Элиспот для определения клеточного иммунного ответа (Т-лимфоциты) к антигенам боррелии.
ELISPOT дает и качественную (тип иммунного белка), и количественную информацию (число клеток активированных определенным антигеном).
Анализы на антитела к Боррелии Бургдорфери в раннем периоде (в среднем до 3-6 недель после заражения) мало информативны. Достаточно длительное серологическое окно препятствует правильной диагностике и лечению, особенно при стертых проявлениях 1 стадии боррелиоза. Выработка антител в объемах необходимых для диагностики существующими тестами может нарушиться после длительного приема препаратов группы глюкокортикостероидов, цитостатиков. Часто по анализам на антитела не удается контролировать эффективность лечения боррелиоза, так как после проведенного лечения антибиотиками титры антител могут сохраняться длительное время, иногда годы. В случае хронической персистирующей инфекции низкая информативность анализов на антитела связана с малым количеством возбудителя, с преобладанием л-форм бактерий и нарушениями в иммунном ответе.
Анализ методом ELISPOT поможет устранить недостатки серологических тестов.
Уникальная высокая чувствительность ELISPOT анализа дает возможность идентификации даже малочисленных клеточных популяций при антиген-специфичных ответах. Такая высокая чувствительность, во многом, определяется тем, что детектируемый продукт в момент анализа находится на поверхности секретирующей клетки, будучи связан с ее рецепторами до того, как он растворится в жидкой фазе после центрифугирования или деградирует. Это делает ELISPOT анализ значительно более чувствительным, чем ИФА. Пределы его чувствительности ниже 1/100 000, что делает этот метод очень полезным для мониторинга антиген-специфичных ответов в различных областях иммунологических исследований, в том числе при инфекционных заболеваниях.
Преимущества анализа Borrelia ELISPOT:
Антигены в анализе Borrelia ELISPOT:
В лаборатории ArminLabs анализ методом ELISPOT доступен для диагностики инфекций, вызванных возбудителями:
Диагностика Т-клеточного иммунитета: пандемия как драйвер инновации
Диагностика Т-клеточного иммунитета: пандемия как драйвер инновации
Т-клеточный стартап TScan Therapeutics начал коллаборацию с компанией Qiagen для разработки теста на Т-клеточный иммунитет к COVID-19
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Споры о вакцинах и иммунитете против нового коронавируса кажутся бесконечными! От обсуждения ПЦР-диагностики и тестов на антитела дискуссии постепенно смещаются в сторону стойкости иммунитета: но измерить иммунитет человека по-прежнему сложно. Узнаем о том, как пандемия вдохнула новую жизнь в старую технологию и станет ли диагностика клеточного иммунитета доступной, в статье специалиста по Т-клеткам Софьи Касацкой.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа заняла второе место в номинации «Академия & бизнес» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Вакцинация от коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 — одна из самых горячих тем на границе 2020 и 2021 гг. Не утихают споры о безопасности вакцин, разработанных в сжатые сроки, о принципах производства и об основных принципах иммуногенности. Много спорят и о том, стоит ли добровольно прививаться тем, кто уже успел переболеть COVID-19, или, по крайней мере, подозревает об этом. Достаточно ли привиться один раз, а если вирус будет мутировать, как действовать дальше? Достаточно ли переболеть один раз или стоит бояться заболеть одной и той же инфекцией раз в сезон?
Для того чтобы ответить на эти вопросы и понять историю прошлых болезней, нужно изучить иммунную память (также ее называют иммунологической). Как правило, для проверки иммунной памяти на конкретную инфекцию проверяют наличие антител в плазме крови: ИФА-тест на антитела класса IgG (ИФА — иммуноферментный анализ). В этом тесте подсчитывается количество антител, которые сорбируются (прилипают) к стандартизированным антигенам, то есть молекулам, встречающимся именно у возбудителя данной инфекции и нигде больше. Антитела, в особенности класса IgG, поразительно точно и выборочно контактируют с однажды «выбранной» молекулой: мало где в биологии можно найти более точные и постоянные молекулярные контакты. Тем не менее тест на антитела — по большей части дань историческому процессу, а не «золотой стандарт» тестирования иммунной памяти. Пандемия стремительно изменила многие аспекты нашей жизни — может ли она поменять и то, что мы считаем стандартом в диагностике иммунитета?
Увидеть адаптивный иммунитет
«Биомолекула» неоднократно писала об уникальных механизмах, которые обеспечивают работу этой удивительной регуляторной системы — системы адаптивного иммунитета человека [1–3].
Чтобы увидеть Т-клетки и В-клетки разных типов, иммунологи чаще всего используют проточную цитометрию (FACS) [4]. Например, если мы хотим увидеть клетки памяти, то крепим флуоресцентную метку на молекулу, присутствующую только на поверхности клеток иммунной памяти, и подсчитываем клетки, пролетающие по одной через лазер и детектор флуоресценции.
Так можно узнать процент клеток, выполняющих определенную функцию, например, весь объем клеток памяти в крови на все прошлые инфекции. Теперь усложним задачу и выделим только клетки памяти на конкретную инфекцию — например, интересующий всех SARS-CoV-2, — как это сделать? Мы можем увидеть недавно активированные клетки среди клеток памяти. Лимфоциты из образца крови пациента смешиваются и инкубируются с молекулами, принадлежащими вирусу, чаще всего, — с очищенными белками, нарезанными на фрагменты. Т- и В-клетки, способные узнать и связать вирусный антиген, активируются, станут активированными эффекторными клетками, и мы сможем их различить среди всей иммунной памяти на FACS-анализе. Такие тесты проводятся в качестве дополнительных научных исследований.
Тест требует не только несколько часов на выделение клеток и их активацию вирусными белками либо пептидами, но и время дорогостоящего специалиста по проточной цитометрии, у которого прибор для FACS всегда работает и настроен, а не простаивает. Сочетание сразу двух факторов приводит к тому, что метод далеко не массовый. Можно представить метод рутинным в нескольких ведущих медицинских центрах, но сложно распространить: на порядки сложнее, чем внедрить регулярное ПЦР-тестирование.
Антитела или Т-лимфоциты
В качестве гораздо более дешевого и доступного теста, чем FACS, иммунологи смотрят не на сами клетки, а на то, что иммунные клетки производят [5]. Вспомним рецепторы, которые служат для решения задачи точного, прочного и выборочного связывания вирусных белков-антигенов. Т-клетки держат рецепторы на поверхности, на клеточной мембране. А вот В-лимфоциты свои уникальные рецепторы синтезируют как в мембранной, так и в растворимой форме — эти растворимые В-клеточные рецепторы и есть антитела. Получается, что вместо флуоресцентных меток и В-клеток памяти можно просто измерить концентрацию антител? Вдобавок, учебник иммунологии рассказывает, что В-клетки формируют память с помощью Т-клеток. Значит ли это, что если антитела есть, то уже произошло формирование памяти: сначала на уровне Т-клеток, затем на уровне В-клеток?
Да, текущие представления об иммунологии человека говорят: высокий уровень антител подразумевает, что Т-клеточный иммунный ответ тоже есть. Тем не менее известны и неклассические механизмы, при которых В-клетки быстро начинают производить антитела (чаще классов IgD, IgM) вне особых зон лимфоузла и при меньшем контроле со стороны Т-клеток. Обратная логика оказывается неверной: Т-клеточная иммунная память не зависит от наличия антител в крови, формируется независимо и сохраняется дольше.
Интуитивно кажется, что было бы отлично сохранять в крови антитела к коронавирусу после вакцинации или инфекции на всю жизнь. Некоторые инфекции формируют такой иммунный ответ, и это коррелирует с иммунной защитой, то есть вероятностью не заболеть при повторном заражении [6]. Но для других инфекций уровень антител в крови достаточно быстро, за несколько месяцев, снижается. Так происходит потому, что за свою жизнь человек встречает сотни тысяч типов вирусов, и производить антитела на все вирусные антигены просто невозможно. Приходится выбирать, происходит конкуренция с защитой от других инфекций, а также конкуренция с антителами, которые нужны для регуляции собственной физиологии организма. Антитела постепенно снижают концентрацию и пропадают из крови, но сохраняются В-клетки памяти, которые смогут вновь производить нужные антитела при необходимости.
Было бы идеально, чтобы организм производил антитела и держал их в оптимальной концентрации в крови не во время повторной болезни, а чуть заранее: до заражения. Именно для этого существуют сезонные ревакцинации: небольшая бустерная доза антигена поступает заранее и через 9–14 дней иммунитет снова подготовлен к сезонному контакту с большим количеством вирусных частиц вокруг. А постоянное, круглогодичное производство антител на высоком уровне можно оставить тем В-лимфоцитам, которые действительно каждый день сталкиваются с одними и теми же бактериями и вирусами: например, В-лимфоцитам слизистой ЖКТ, работающим с кишечными симбионтами.
ELISPOT: ИФА для Т-клеток?
Антитела оказались удобным для измерения косвенным маркером иммунной памяти, но отсутствие антител еще не говорит об отсутствии Т-клеточной памяти. Специфичную иммунную память Т-клеток, к сожалению, нельзя измерить так же легко, по нескольким миллилитрам плазмы крови. Как упоминалось выше, Т-клетки не секретируют свои рецепторы в растворимом виде. Зато Т-лимфоциты, в соответствии со своей ролью дирижеров всего иммунного ответа, вырабатывают множество сигнальных молекул — цитокинов. Цитокины, в большинстве своем, — тоже растворимые молекулы, и их концентрацию можно измерить в объеме (суммарно), либо «подсветить» с помощью флуоресцентных меток сразу при их секреции из специфичных Т-клеток (и увидеть соответствие клетка—сигнал). На этом принципе основан иммуноферментный анализ на клональных отпечатках Т-клеток, или ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot).
Как правило, Т-хелперы секретируют сигнальные цитокины, чья основная задача — активировать нужную ветвь иммунного ответа, привлечь клетки врожденного иммунитета и подавить конкурирующие сигналы. Среди функций цитокинов — подача сигналов внутри иммунной системы — от Т-клеток и для Т-клеток для уточнения принятия решений. Подобная информация «для внутреннего использования» передается и от Т-хелперов Т-киллерам, и в обратном направлении. Яркий пример такого сигнала — интерферон-гамма: активированные Т-киллеры секретируют IFNγ наравне с Т-хелперами. Массовая выработка интерферона позволяет быстро распространить информацию на уровне всего организма. На основе измерения продукции IFNγ Т-клетками разработан самый надежный из ELISPOT-тестов на антиген-специфичный Т-клеточный ответ [7], [8].
Для ELISPOT живые изолированные Т-клетки периферической крови инкубируются с антигенами, как правило, белковыми либо пептидными. Этот процесс должен имитировать то, как в организме Т-клетки в лимфоузлах узнают антигены и активируются: процесс презентации антигена. Небольшая доля специфичных клеток узнает антигены и производит IFNγ, причем интерферон сразу фиксируется и позже визуализируется в точке секреции. В процессе активации Т-клетки делятся: из одной клетки образуется целый клон антигенспецифичных клеток, все они производят интерферон, и при визуализации «пятно» продукции интерферона растет в диаметре (рис. 1). При ELISPOT сложно точно сказать, сколько антигенспецифичных клонов было изначально в образце до активации, размножения и формирования пятна. Остается неясным, сколько Т-клеток узнают антиген in vivo, но не прореагировали из-за искусственной формы презентации антигена, не похожей на то, как Т-клетки обычно активируются в лимфоузлах. С другой стороны, метод немного проще оптимизировать в лаборатории и проще делать для многих пациентов одновременно, чем более дорогостоящий FACS-анализ; требующиеся приборы и реагенты дешевле.
Рисунок 1. Схема работы теста ELISPOT, определяющего активацию Т-лимфоцитов при взаимодействии с антигенами нового коронавируса SARS-CoV-2
[11], рисунок с изменениями
Поиск коронавирусных Т-клеток. Инновация TScan
ELISPOT используется во всех лабораториях, которые исследуют иммунитет человека. Метод ELISPOT и его модификации на пересекающихся пулах пептидов (наборах фрагментов, на которые нарезается белковый антиген) использовались в исследованиях эффективности вакцин от ВИЧ, и позже медленно распространились на исследования и других вакцин. В диагностических лабораториях метод стал популярен потому, что для более точной диагностики туберкулеза необходимо оценивать Т-клеточный иммунный ответ. Коммерческий тест получил название T-SPOT. Кроме туберкулеза, для других инфекций аналогичная диагностика не применялась — до 2020 года и кризиса, вызванного новой коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2. Необходимость широкой диагностики самой инфекции и иммунной памяти к ней подтолкнула одновременно исследователей и производителей диагностических тестов к разработке новых методов и оптимизации старых и привычных. Интерес к быстрому и дешевому измерению Т-клеточной памяти растет параллельно с популярными в медиа опасениями, что у переболевших COVID-19 быстро пропадают антитела в крови.
Очень многие академические коллективы, которые работают на стыке биохимии, иммунологии человека и прикладных биотехнологий, весной 2020 года стали заниматься разработками для борьбы с пандемией, в том числе разрабатывать и налаживать диагностику инфекции. Нельзя не упомянуть пример коллектива Григория Ефимова из НМИЦ гематологии в Москве, активно работающий как над диагностикой Т-клеточного иммунитета к новому коронавирусу на основе FACS, так и в коллаборации по созданию одного из ИФА-тестов для определения антител к антигенам SARS-CoV-2 [9], [10]. Тем не менее вернемся к теме масштабируемого производства быстрых ELISPOT-тестов на Т-клеточный иммунитет: откуда берутся такие разработки, тоже из фундаментальных и клинических академических лабораторий?
Первой ELISPOT-тест на ковид (T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 assay) выпустила компания Oxford Immunotec, ранее создавшая одну из самых популярных версий теста на туберкулез [11]. Этот тест использует пул разнообразных антигенов коронавируса и активацию Т-клеток в смеси с другими лейкоцитами периферической крови: иначе говоря, дизайн теста даже несколько упрощен по сравнению с тестом на туберкулез (рис. 1).
Куда более интересную модификацию запустил небольшой биотех-стартап под названием TScan Therapeutics. Этот стартап переориентировался на инфекционную иммунологию во время пандемии. Как и многие другие коллективы, к примеру, BioNTech (разработчик вакцины от коронавируса совместно с Pfizer), до пандемии они занимались онкологией и задачей оптимальной активации противоопухолевого иммунитета.
Осенью 2020 года TScan Therapeutics подписали соглашение о совместной разработке диагностического теста ELISPOT-типа с компанией Qiagen — крупнейшим производителем лабораторных реагентов и универсальных наборов для типовых экспериментов в молекулярной и клеточной биологии [12], [13]. Эта диагностика Т-клеточной памяти во многом отличается от версии Oxford Immunotec, и в первую очередь отличается идеологически: оксфордская компания быстро и практично сделала аналог своего существующего продукта-бестселлера, сохранив всю платформу и протокол метода и изменив только антиген. TScan же демонстрирует почти идеальный инновационный подход: вначале провели исследования Т-клеточного иммунитета, опубликовали выводы в престижном журнале Immunity, затем появилась идея для диагностического теста и, наконец, возможность производства в партнерстве с Qiagen.
Исследование TScan раскрывает детали того, какие молекулы среди белков коронавируса вызывают наибольший «интерес» у Т-клеток человека [14]. Иммунная память Т-киллеров, согласно исследованию, формируется не только и не столько на фрагменты антигена (эпитопы) S-белка коронавируса, на котором сфокусировано большинство вакцин 2020 года [15]. Напротив, эпитопов гораздо больше в нуклеокапсидном основном белке [16]. Далее, специалисты TScan показали отсутствие перекрестного иммунитета: антигены «сезонных» неопасных человеческих коронавирусов формируют память Т-киллеров, но эти Т-киллеры не способны отреагировать на коронавирус SARS-CoV-2. Наоборот, между SARS-CoV-1 (вызвавшим вспышку атипичной пневмонии в 2003 году) и SARS-CoV-2 существует значительная кросс-реактивность Т-клеток (переболевшие атипичной пневмонией могут быть защищены от SARS-CoV-2).
Обнаружение важнейших участков вируса, вызывающих долгую Т-клеточную память — это поиск иммунодоминантных эпитопов. Если активировать Т-клетки именно такими пептидами, можно существенно повысить качество диагностического теста. Уникальные данные TScan позволяют вычесть фон иммунной памяти на родственные и далекие коронавирусы и поднять специфичность диагностики иммунной памяти. При этом используется платформа, сходная с ELISPOT, что позволяет объединять много образцов и делать тест быстрым и широко доступным. Сейчас исследования Т-клеточного иммунитета при коронавирусе проводится либо в рамках научных исследований, либо на коммерческой основе, но точность и интерпретация теста затруднена, клиент получает результат через 1–2 неделю после теста. Партнерство TScan с Qiagen вселяет оптимизм по поводу доступности теста: ведь продукцией этой компанией пользуются буквально в каждой молекулярной и биохимической лаборатории на планете.
Интересна еще одна деталь. Исследователи из TScan брали донорские Т-клетки у доноров с наиболее распространенными в США генотипами других важных иммунных молекул: молекул HLA (молекул главного комплекса гистосовместимости, Human Leukocyte Antigen) подтипов HLA-A*02:01, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*24:02 и HLA-B*07:02. В зависимости от типа молекул HLA Т-клетки будут распознавать разные эпитопы одного и того же вируса. А поскольку у разных людей максимально вариабельные молекулы HLA, то и иммунный ответ Т-клеток у каждого формируется максимально индивидуально. Именно с этим связаны и сложности/дороговизна изучения Т-клеточного иммунитета, и невозможность «перелить иммунную память» переливанием крови — такой эксперимент может получиться только внутри пары однояйцевых близнецов. С другой стороны, даже в этом огромном разнообразии реакций клеточного иммунитета Т-клетки разных доноров, отвечающие на новый коронавирус, обладают некоторыми общими характеристиками.
Данные об общих параметрах иммунного ответа, которые будут накапливаться в совместных исследованиях TScan/Qiagen, представляют несомненный интерес для оптимизации лечения пациентов и создания методов лечения, таргетно направленного на активный и безопасный Т-клеточный ответ. Здесь проявляется особая черта сильных deeptech-стартапов в области биологии, биоинформатики и биотехнологий: технологическая платформа может быть использована не только для одного применения и быстрого завоевания рынка, а для разных задач, и в процессе, по ходу решения прикладной задачи возникают ценные, качественные и заметные научные открытия. Конечно, новость о сотрудничестве TScan и Qiagen — всего лишь одна из множества историй о биотех-прорывах 2020 года, и легко могла затеряться среди других новостей и инноваций. Но в этой неприметной новости заложен мощный потенциал, способный изменить современные представления о клинической диагностике иммунной памяти.