днк технология основы полимеразной цепной реакции методическое пособие
Основы полимеразной цепной реакции
Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)
ОТ СОСТАВИТЕЛЯ
Цель пособия «Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)» – помочь овладеть навыком в постановке ПЦР. Рассмотрены стадии проведения ПЦР, способы контроля прохождения реакции, типичные ошибки интерпретации результатов.
Представлены перспективы практического использования и современные тенденции развития ПЦР-диагностики.
Пособие предназначено для тех специалистов, которые готовятся к открытию клиникодиагностических лабораторий, а также может быть использовано сотрудниками уже действующих лабораторией.
Мы надеемся, что с помощью нашего пособия каждая диагностическая лаборатория сможет проводить ПЦР-диагностику на высоком уровне.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Механизм полимеразной цепной реакции 9
1.1. Компоненты реакционной смеси 9 1.1.1. Основные компоненты 9 1.1.2. Дополнительные компоненты 10
1.2. Циклический температурный режим 10 1.3. «Эффект плато» 12
2. Стадии постановки ПЦР 13
2.1. Подготовка пробы биологического материала 13
2.2. Способ постановки ПЦР 14
2.3. Детекция результатов ПЦР 17 2.3.1. Метод горизонтального электрофореза 17 2.3.2. Метод вертикального электрофореза 18 2.3.3. Метод гибридизации после амплификации 19 2.3.4. Метод гибридизации в процессе амплификации 19
3.1. Производственный контроль 23
3.2. Внешний контроль работы лаборатории 23
3.3. Внутренний контроль качества 24 3.3.1. Внутренние контроли 25 3.3.2. Положительный контроль 26 3.3.3. Отрицательный контроль 26 3.3.4. Специальные контроли 26
4.1. Ошибки преаналитического этапа 29 4.1.1. Место взятия биологического материала 29 4.1.2. Правильность взятия биологического материала 29 4.1.3. Обработка биологического материала 30 4.1.4. Хранение биологического материала 30 Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)
4.2. Ошибки аналитичес
ВВЕДЕНИЕ
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).
Открытию полимеразной цепной реакции предшествовало развитие молекулярно-биологических технологий.
В 1869г. И. Мишером была открыта ДНК. Биологическая функция нового вещества была не ясна.
Вплоть до 50-х годов XX века точное строение ДНК и способ передачи наследственной информации оставались неизвестными, хотя и было доказано, что ДНК состоит из нескольких цепочек, состоящих из нуклеотидов.
Количественные соотношения между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК были сформулированы в 1949–1951 гг. группой биохимика Э. Чаргаффа и получили название «правила Чаргаффа». Суть этих правил аключалась в следующем:
1. Количество аденина (А) равно количеству тимина (Т), а гуанина (Г) – цитозину (Ц): А=Т, Г=Ц.
2. Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А+Г=Т+Ц.
Правила Чаргаффа, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК и определении принципа комплементарности Дж. Уотсоном и Ф. Криком в 1953 году. Ученые пришли к выводу, что ДНК состоит из двух полимерных цепей, удерживаемых водородными связями между азотистыми основаниями и образующих двойную спираль.
При этом азотистые основания формируют парные (комплементарные) комплексы аденин – тимин и гуанин – цитозин при взаимодействии цепей нуклеиновых кислот (рис.1). Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи – матрицы.
Рис.1. Принцип комплементарности
Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)
В 1955г. А. Корнберг открыл фермент, который назвал ДНК-полимеразой. Этот фермент способен удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3′-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был связан с комплементарной цепью ДНК (матрицей). Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), используемые в качестве строительных блоков.
В 1971г. Клеппе и соавт. представили данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси, и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК.
Однако возможность использования ПЦР в плане наработки большого количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Это было связано с техническими трудностями, обусловленными необходимостью трудоемкого синтеза праймеров, и нестабильностью фермента. В начале использования метода ПЦР после каждого цикла нагревания – охлаждения ДНК-полимеразу приходилось добавлять в реакционную смесь, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента.
В 1975г. Т. Брок и Х.Фриз открыли Thermus aquaticus – грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию, а в 1976 г. из нее была впервые выделена Taq-полимераза.
Преимуществом данного фермента была способность стабильно работать при повышенных температурах (оптимум 72-80 °C).
В 1983-1984 гг. К. Мюллис провел ряд экспериментов по разработке ПЦР и первым начал использовать Taq-полимеразу вместо неустойчивой к высоким температурам ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис вместе с Ф. Фалуном разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.
Таким образом, сформировался принцип использования ПЦР, как метода амплификации in vitro заданных фрагментов ДНК с полностью или частично известной последовательностью.
Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Это, в свою очередь, способствовало значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов.
В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки различных применений метода.
Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.
Механизм полимеразной цепной реакции
1. Механизм полимеразной цепной реакции
1.1. Компоненты реакционной смеси 1.1.1. Основные компоненты Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов.
Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации.
Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:
z Быть специфичными. Особое внимание уделяют 3′-концам праймеров, так как именно с них Taqполимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то высока вероятность, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить процессы неспецифического связывания, и синтеза фрагментов различной длинны, отличных от искомых. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.
z Не должны образовывать димеры и петли, то есть не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига (комплементарного присоединения) праймеров самих на себя или друг с другом.
z Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.
Taq-полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) – «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.
Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) 1.1.2. Дополнительные компоненты Для удобства детекции или контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси могут быть включены дополнительные компоненты.
Внутренние контроли – гетерологичный специфическому фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный (фланкированный) специфическими праймерами. Фактически, представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке.
ДНК-зонды – искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера (около 30 нуклеотидов), комплементарные специфическим ампликонам (продуктам реакции). Благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам ДНК-зонды могут использоваться для детекции продуктов реакции.
1.2. Циклический температурный режим Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, которые обеспечиваются определенными температурными циклами.
Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:
1. Денатурация – это переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур (рис. 2).
2. Отжиг – это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.
Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит.
Механизм полимеразной цепной реакции
3. Элонгация (синтез). После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3′-конца праймера.
Температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, которая с максимальной эффективностью начинает синтез второй цепи ДНК от 3′-конца праймера, связанного с матрицей, и движется в направлении от 3′ к 5′ концу (рис. 3).
Иногда в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию. Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается (рис. 4).
Рис. 4. Этапы ПЦР
Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой:
2n, где А – количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации;
М – начальное количество ДНК-мишеней;
n – число циклов амплификации.
Реальное значение эффективности отдельных циклов амплификации составляет по некоторым данным 78-97%.
Если в пробе присутствуют ингибиторы реакции это значение может быть намного меньше, поэтому фактическое количество специфических продуктов амплификации лучше описывает формула:
Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)
А = М*(1+Е)n, где Е – значение эффективности реакции.
Следует заметить, что в процессе амплификации на исходной цепи синтезируются и длинные фрагменты, однако их накопление происходит лишь в арифметической прогрессии по формуле:
К = М*n, где К – количество длинных продуктов амплификации.
Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.
Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает – «эффект плато».
Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3–1 пмолей.
В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения «эффекта плато» влияют:
z Утилизация субстратов (дНТФ и праймеров).
z Стабильность реагентов (дНТФ и фермента).
z Количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы.
z Неспецифические продукты и праймер-димеры, конкурирующие за праймеры, дНТФ и полимеразу.
z Концентрация специфического продукта за счет неполной денатурации при высокой концентрации ампликонов.
Стадия постановки ПЦР
2. Стадии постановки ПЦР ПЦР-анализ состоит из трех стадий.
2.1. Подготовка пробы биологического материала Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации.
Иногда достаточным бывает кипячение образца в течение 5–10 минут, однако в большинстве случаев требуются более трудоемкие методы.
Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, предложенная Marmur. Она включает в себя ферментативный протеолиз клеток с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Однако это метод довольно трудоемкий и предполагает работу с такими токсичными веществами, как фенол и хлороформ.
Популярным в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавт.
Он основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента – гуанидина изотиоционата (GuSCN) высокой молярности (5М) с последующей сорбцией ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен и технологичен для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок, что имеет большое значение при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода важны правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологии.
Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, так кака возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.
Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, ингибирующие ПЦР. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца, в результате которого клеточные стенки разрушаются, а нуклеиновые кислоты выходят в раствор; и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом.
Тем не менее, встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, клеточные стенки некоторых микроорганизмов не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.
При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, допускается использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время, использование подобных методов пробоподОсновы полимеразной цепной реакции (ПЦР) готовки для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам, вследствие использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК.
Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.
2.2. Способ постановки ПЦР На данный момент разработаны варианты постановки ПЦР, направленные на решение следующих задач: увеличение эффективности реакции и снижение риска образования неспецифических продуктов; реализацию возможности проведения как качественного, так и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК/РНК.
Наиболее распространенными в клинико-диагностических лабораториях модификациями ПЦР являются:
ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) – модификация, суть которой состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.
Для этого полимеразная активность фермента в момент постановки ПЦР блокируется антителами или имитирующими антитела небольшими молекулами типа Affibody до наступления первой денатурации (проводится при 95 °C в течение 10 минут).
Кроме того, для предотвращения преждевременного взаимодействия фермента с компонентами реакционной смеси и, как следствие, образования неспецифических продуктов реакции до момента полного прогрева, используется легкоплавкий парафин или специальные масла, отделяющие полимеразу от реакционной смеси.
В зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления Тm, при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, то есть температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двуцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и таким образом обеспечивает специфичность реакции.
Даже если неспецифический отжиг произошел до начала температурного циклирования, в отсутствии фермента элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.
Таким образом, ПЦР с «горячим» стартом позволяет минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа.
ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) – используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности РНК. На первом этапе с помощью реверСтадия постановки ПЦР тазы (обратной транскриптазы), используя в качестве матрицы мРНК, проводят синтез одноцепочечной молекулы ДНК (кДНК), которая используется для последующей ПЦР. Для этого применяют обратную транскриптазу, выделенную из двух вирусов: Avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus.
Использование ревертазы связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, данный фермент термолабилен и поэтому может быть использован при температуре не выше 42°С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Этот недостаток может быть устранен при использовании в качестве обратной транскриптазы термостабильной полимеразы, проявляющей активность в присутствии ионов Мn2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную, так и транскриптазную активность.
Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси так же, как и в ПЦР, в качестве затравки должны присутствовать праймеры и смесь 4-х дНТФ.
Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения этого метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК.
ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (End-point PCR) – это модификация метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирки. Таким образом, решается одна из основных проблем ПЦР – проблема контаминации ампликонами.
Одним из таких вариантов является метод «FLASH» (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization – специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами).
Ключевым элементом метода «FLASH» является использование гибридизационных олигонуклеотидных зондов, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя. Зонды добавляют в реакционную смесь наряду с праймерами и остальными компонентами реакции. Поскольку в структуре зонда флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости друг от друга, то перед началом реакции флуоресценция отсутствует.
Во время реакции зонды гибридизуются с ДНК-мишенью, на стадии элонгации Taq-полимераза разрушает зонд благодаря 5′-экзонуклеазной активности и флуорофор оказывается свободным от гасителя. Таким образом, количество разрушенных зондов и, соответственно, уровень флуоресценции оказываются пропорциональными количеству образовавшихся ампликонов. Следует отметить, что регистрация флуоресценции происходит с помощью детектора флуоресценции после окончания реакции, поэтому метод не является количественным.
ПЦР в режиме «реального времени» (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) – используется для одновременной амплификации и измерения количества искомой молекулы ДНК. Преимуществом данного подхода является возможность совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце в реальном времени после каждого цикла амплификации.
Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Для этого используют флуоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК (интеркаляция возможна в случае, если краситель имеет подходящие размеры и химическую природу и может поместиться между основаниями ДНК) или модифицированные дезоксинуклеотиды, которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.
Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР для измерения малых количеств мРНК, что позволяет получать количественную информацию о содержании искомой мРНК в клетке и судить об уровне экспрессии гена в отдельной клетке или ткани.
Отличительными чертами ПЦР-РВ являются не только возможность количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, но и отсутствие стадии электрофореза, что позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Также менее строгие требования предъявляются к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР – это одновременная амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке. Преимуществом данного метода является возможность выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т.д., поместив пробу в одну пробирку.
Кроме того, возможны и другие варианты ПЦР, получившие наибольшее распространение в научно-исследовательских лабораториях, например:
Гнездовая («вложенная», англ. nested PCR) ПЦР – применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции.
Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
ПЦР «инвертированная» – используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для этого проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов.
Ассиметричная ПЦР – проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Сама ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.
Метод молекулярных колоний – данная модификация основана на использовании акриламидного геля, который до начала ПЦР полимеризуют со всеми ее компонентами на поверхности. В процессе реакции в точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
Стадия постановки ПЦР
ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) – вариант ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Для реализации данного подхода используют смесь двух полимераз, одна из которых – Taq-полимераза с высокой процессивностью (способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая – ДНК-полимераза с 3′-5′ экзонуклеазной активностью (Pfu- полимераза). Она необходима для корректирования ошибок, внесённых Taq-полимеразой, при этом некомплементарные нуклеотиды удаляются с помощью Pfu-полимеразы.
Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) – ПЦР с использованием консервативных праймеров к последовательностям ДНК для родственных групп внутри одного или между разными видами. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов.
ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (RACE-PCR) Иммуно-ПЦР (immuno-PCR-IPCR)
2.3. Детекция результатов ПЦР
На сегодняшний день существует несколько основных способов детекции результатов ПЦР:
z Электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле) z Гибридизационно – ферментный
z Гибридизационо – флуоресцентный:
– регистрация продукта после окончания реакции амплификации – «анализ по конечной точке»;
– детекция продукта в режиме «реального времени».
2.3.1. Метод горизонтального электрофореза Наиболее распространенным до недавнего времени являлся метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру (рис. 5). В этом случае визуализацию результатов проводят в пластине агарозного геля, который представляет собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например бромистого этидия.
Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют лунки, в которые вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения.
Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют:
концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК.
Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, который излучает свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 – 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).
Яркость полос продуктов амплификации может быть различной, поэтому часто в ПЦРлабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце.
Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.
2.3.2. Метод вертикального электрофореза Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом.
Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид и специальную камеру для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК с точностью до одного нуклеотида. Однако приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного, кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют.
Оба варианта электрофоретической детекции позволяют осуществлять только качественный анализ и сопряжены с рядом проблем:
z Большие затраты времени на стадию детекции z Невозможность автоматизации z Сложность и субъективность трактовки результатов
z Высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение:
– повышенные требования к организации лаборатории;
– максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР;
– выделение отдельного сотрудника на стадию детекции;
– постоянный контроль смывов;
– большое количество К- для контроля контаминации ампликонами и, как следствие, увеличение объема расходных материалов и времени для подготовки к проведению детекции.
Стадия постановки ПЦР
2.3.3. Метод гибридизации после амплификации Другой способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов с продуктами амплификации. Зонды представляют собой искусственно синтезированные участки ДНК, содержащие ту или иную метку, детектируемую специальными приборами.
Для детекции продуктов ПЦР после окончания реакции амплификации необходимо специальное оборудование – детектор флуоресценции (например, приборы «Джин» или «Джин-4» производства НПФ «ДНК-Технология»).
В процессе своей работы прибор регистрирует флуоресцентное излучение, возникающее в реакционной смеси при освещении образца источником возбуждающего света. Регистрация производится последовательно для каждой из пробирок при её позиционировании относительно оптического блока с помощью шагового двигателя.
Флуорофоры для каждой из мишеней (например, для специфического искомого участка ДНК и внутреннего контроля) имеют свою длину волны, это позволяет регистрировать одновременно несколько сигналов по соответствующим каналам, что повышает производительность метода.
Такой подход позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами амплификации. Детекция результатов проводится в закрытых пробирках, что позволяет осуществлять ПЦР-исследования в одной комнате и обходиться меньшим количеством персонала. Кроме того, регистрация, интерпретация и хранение полученных результатов проводятся автоматически.
В результате указанный способ детекции существенно сокращает время проведения анализа и исключает возможность субъективной оценки полученных результатов, что повышает качество работы лаборатории. Тем не менее необходимо помнить, что реализация данного подхода позволяет проводить только качественный анализ.
Различные варианты детекции по конечной точке позволяют оценить количество исходной ДНК методом серийных разведений, определяя количество работающих разведений и сравнивая их с контрольными образцами с известной концентрацией ДНК. Однако данный подход является слишком трудоемким и практически не применяется в условиях диагностических лабораторий.
2.3.4. Метод гибридизации в процессе амплификации Данный метод, как упоминалось ранее, позволяет учитывать результаты реакции, не открывая пробирки. Регистрация результатов по уровню флуоресценции происходит с помощью специального оборудования.
Ключевым элементом метода является использование гибридизационных олигонуклеотидных зондов, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя.
Наиболее часто применяется флуоресцентный краситель 6-FAM (6-карбоксифлуоресцеин), с длинной волны возбуждения 488 нм, который легко связывается с олигонуклеотидами и обеспечивает высокую интенсивность сигнала. Поэтому под анализ с его использованием адаптированы многие приборы.
Также активно применяют SYBR Green I, который при связывании с двухцепочечной ДНК вызывает увеличение флуоресценции. В качестве референсного красителя широко используется ROX.
Для выявления продуктов амплификации применяют следующие наиболее распространенные подходы:
Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение.
Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями – методика отличается от описанной выше тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области, а флуорофор и гаситель присоединяют к концевым нуклеотидам. При температуре отжига свободные зонды образуют шпильки за счет наличия комплементарных участков. При этом флуорофор и гаситель оказываются в непосредственной близости, что приводит к тушению флуоресценции.
При отжиге праймеров зонды комплементарно присоединяются к амплифицируемому участку ДНК, гаситель оказывается пространственно отделен от флуорофора и наблюдается рост флуоресцентного сигнала. Такие зонды часто называют «молекулярными беконами»
(molecular beacons) (рис. 7).
Рис. 7. Зонды с комплементарными концевыми последовательностями Стадия постановки ПЦР Таким образом, количество присоединившихся зондов и, соответственно, уровень флуоресценции оказываются пропорциональными количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР.
Использование интеркалирующих красителей – этот способ детекции основан на том, что флуоресценция интеркалирующих красителей значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.
Для анализа в режиме «реального времени» используют специальные ДНК-амплификаторы с оптическим блоком, позволяющие детектировать флуоресценцию внутри реакционной пробирки в ходе реакции.
При амплификации образца детектируемый флуоресцентный сигнал может состоять из трех последовательных участков:
1 – базовая линия (сигнал не превышает предела детектирования прибора);
2 – экспоненциальная амплификация;
Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом, момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового – так называемый пороговый цикл – зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.
Главным преимуществом детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени» является возможность проведения количественного анализа.
При количественном исследовании образцов каждая серия экспериментов сопровождается постановкой амплификации с контрольными образцами, в которых заведомо известно количество ко
«НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ЗООЛОГИИ ИМ. И. И. ШМАЛЬГАУЗЕНА Дзеверин Игорь Игоревич УДК 599.426:[591.471.4+575.8] МЕХАНИЗМЫ ТРАНСФОРМАЦИИ СТРУКТУР ЧЕРЕПА В ЭВОЛЮЦИИ НОЧНИЦ И РОДСТВЕННЫХ ГРУПП ГЛАДКОНОСЫХ РУКОКРЫЛЫХ 03.00.08 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Киев – 2011 Перевод с украинского Диссертацией является рукопись Работа выполнена в отделе эволюционно-генетических основ систематики Института зоологии им. И.И. »
«Олег Вячеславович Локуциевский Олег Вячеславович Локуциевский (1922-1990) – выдающийся математик, жизнь которого была связана с двумя замечательными московскими научными центрами – Московским университетом и Институтом прикладной математики им. М.В. Келдыша. О.В.Локуциевский родился 11 ноября 1922 г. в Новосибирске. В 1937 году семья переезжает в Москву. Об отце, матери Олега Вячеславовича и о причине переезда в Москву можно прочитать в отрывке из воспоминаний вдовы Олега Вячеславовича Тамары. »
«Косолапость Это врожденная артро-, мио-, десмо-, дерматогенная контрактура, состоящая из следующих компонентов: 1) эквинус в голеностопном суставе; 2) супинациия наружного края стопы (главным образом предплюсны и пятки); 3) аддукциия. Эпидемиология. ВК составляет 3%-4% всех ортопедических заболеваний, занимая в Беларуси 2-е место среди детских ортопедических заболеваний после врожденного вывиха бедра. Этиология. Теория врожденных пороков зародыша. Механическая теория. Нейромышечная теория. »
«СИНЕРГЕТИКА АТМОСФЕРЫ И СМЕРЧА КАК ПРИРОДНЫХ САМОПОДДЕРЖИВАЮЩИХСЯ ТОРОВЫХ МЕХАНИЗМОВ В. Н. Шихирин ELASTONEERING INC, and Independent Scientist and Inventor Chicago, USA «Текст писался «на одном дыхании», поэтому могут быть неточности, но не принципиальные, легко исправляемые с описанием соответствующих пояснений и дополнений в следующих генерациях автора». Не президенты стран, а неординарные личности, как Виктор Шаубергер и Никола Тесла, решают судьбу Человечества Введение Мы с Вами должны. »
«Радиация и риск. 2014. Том 23. № 4 Научные статьи Действие редкои плотноионизирующего излучения на популяцию chlorella vulgaris Ляпунова Е.Р., Комарова Л.Н. ИАТЭ НИЯУ МИФИ, Обнинск, Россия Несмотря на интенсивные исследования проблемы относительной биологической эффективности (ОБЭ) ионизирующих излучений, различающихся по линейной передаче энергии (ЛПЭ), механизмы, обуславливающие различие ОБЭ, не до конца выяснены. В работе представлен сравнительный анализ результатов действия редкои. »
«1979 г. июль—август т. 34, вып* 4 (208) УСПЕХИ МАТЕМАТИЧЕСКМХНАУК БОРИС ЗАХАРОВИЧ ВУЛИХ Некролог 1 сентября 1978 г. скоропостижно скончался известный советский математик, заве дующий кафедрой математического анализа Ленинградского университета Борис Заха рович Вулих. Б. 3. Вулих родился в Ленинграде 13 февраля 1913 г. в семье профессора математи ки Захара Захаровича Вулиха. В 1936 г. окончил математико-механический факультет Ленинградского университета, в 1938 г.— аспирантуру там же. В 1938. »
«Бурнашев Константин Эдуардович ЧЕЛОВЕК В ПРОСТРАНСТВЕ СОЦИАЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ Статья посвящена анализу феномена социальных стандартов человека. Рассматриваются сложившиеся социальные стандарты, прослеживается их генезис и место в современном обществе. Выявляются ценности и императивы, лежащие в основании рассмотренных стандартов. Анализируется влияние социальных стандартов на формирование человека. Рассматриваются механизмы стандартизации. Адрес статьи: www.gramota.net/materials/3/2012/7-2/8.html. »
«Форма 7 (ОБРАЗЕЦ ЗАПОЛНЕНИЯ) Наукометрическая анкета руководителя темы Анкета текущих наукометрических показателей фундаментальных научных исследований и результативности в подготовке научных кадров отдельного сотрудника или лидера научной группы (в дальнейшем именуемого заявителем). ФИО, факультет, кафедра, должность ОБРАЗЕЦ ЗАПОЛНЕНИЯ: Иванов Иван Иванович, физический факультет, кафедра атомной физики, профессор, д.ф.-м.н ОБЛАСТЬ ЗНАНИЯ: (математика, механика и информатика; физика и. »
«ОБОРУДОВАНИЕ И ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ НЕФТЕГАЗОВОГО КОМПЛЕКСА Издается с 2001 г. №5 Выходит 6 раз в год Октябрь 2013 г. С ОДЕРЖА НИЕ Машины и оборудование Башмур К.А., Петровский Э.А. Динамика системы верхнего привода буровой установки Арифулин Р.Х., Ходырев А.И., Каштанов И.М. Задвижка: анализ материально-конструктивного исполнения; расчетный силовой анализ; определение путей оптимизации Габдрахимов М.С., Фахриева К.Р. Динамические нагрузки скважинного оборудования и виброзащита УЭЦН Захаров Б.С. »
«Выпуск 4 (23), июль – август 2014 Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ» publishing@naukovedenie.ru http://naukovedenie.ru УДК 37.013.2 Левин Игорь Леонидович ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный архитектурно-строительный университет» Россия, Нижний Новгород1 Доцент кафедры рисунка и живописи Кандидат педагогических наук, доцент E-Mail: levin-il@yandex.ru Механизм творческой самореализации личности в контексте креативной парадигмы образования Аннотация. В статье на основе методологии. »
«МАРКЕТИНГОВЫЕ КОММУНИКАЦИИ В ДОПОЛНИТЕЛЬНОМ ПРОФЕССИОНАЛЬНОМ ОБРАЗОВАНИИ Н.Р. Вакулич Институт дополнительного профессионального образования Саратовского государственного университета имени Н. Г. Чернышевского В настоящее время в системе российского профессионального образования происходят трансформации, которые качественно меняют уже сложившийся за последнее десятилетие механизм оказания дополнительных профессиональных образовательных услуг. Не смотря на то, что вступивший в силу с 01 сентября. »
«ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 501.001.22 на базе Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» ПО ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА НАУК аттестационное дело №_ решение диссертационного совета от 15 мая 2015 г., протокол №4/260 О присуждении Полехину Ивану Юрьевичу, гражданину Российской Федерации, ученой степени кандидата физико-математических наук. »
«ВЫВОД ИЗ ЭКСПЛУАТАЦИИ АЭС. Базовые принципы и механизмы для обеспечения социально-экологической устойчивости регионов вывода из эксплуатации АЭС и обращения с РАО и ОЯТ. Михаил Вивсяный, Олег Бодров Ленинградская АЭС (ЛАЭС), старейшая в мире электростанция с уранграфитовыми реакторами РБМК-1000. В 2018 году она выработает продленный до 45 лет ресурс. Вывод ее из эксплуатации (декомиссия) может стать примером построения оптимальной технологический, социально-экологической и экономической модели. »
Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.