Тест активации базофилов что это

Исследование активации базофилов аллергенами методом проточной цитофлуориметрии (Flow CAST®)

Биоматериал

Для данного исследования лаборатория принимает следующий биоматериал:

Подготовка к исследованию

Условия подготовки пациента определяются лечащим врачом.

Взятие биоматериала рекомендуется проводить не ранее, чем через 4-6 недель после перенесенной реакции:

Взятие крови проводится только в Центральном офисе при лаборатории (ул. Новогиреевская д.3а) один раз в неделю, строго по средам с 6:30 до 13:00.

Метод исследования

Исследование активации базофилов (тест активации базофилов, basophil activation test) – функциональный тест, позволяющий выявить непосредственную реакцию базофильных лейкоцитов крови на стимуляцию различными аллергенами. Этот тест дает возможность моделировать взаимодействие с аллергеном в пробе крови («провокационный тест в пробирке»).

Оценку активации базофилов проводят методом проточной цитофлуориметрии, используя в качестве маркера белок внутриклеточных гранул CD63. При дегрануляции базофилов внутриклеточные везикулы сливаются с мембраной клетки, и белок CD63 презентуется на поверхности базофила. Повышение уровня экспрессии CD63 свидетельствует об активации клеток под действием исследуемого аллергена.

Показания к исследованию:

Внимание! Услуга 155000 «Исследование активации базофилов аллергенами методом проточной цитофлюориметрии (Flow CAST ® )» может быть заказана только совместно с лекарственными аллергенами, является обязательной и выполняется однократно при любом количестве тестируемых аллергенов.

Включает определение фонового уровня активации базофилов в крови пациента (до стимуляции аллергенами), а также принципиальную способность базофилов отвечать на стимуляцию как иммунологическим, так и неиммунологическим путем. Величину фоновой активации базофилов применяют для расчета индексов активации базофилов под воздействием аллергенов.

Для исследования активации базофилов доступны лекарственные аллергены:

Анальгезирующие ненаркотические и нестероидные противовоспалительные средства:

Источник

Тест активации базофилов в диагностике аллергических заболеваний. Обзор

Трудности и преимущества использования метода,
клиническое применение.

Помимо CD63 идентифицирован ряд других маркеров активации, среди них CD203c (4). По некоторым данным CD203c, по-видимому, коэкспрессируется с CD63, но пути их активации различаются (5). В соответствии с согласительным документом EAACI, посвященном применению ВАТ в диагностике аллергических заболеваний (2), тест активации с CD63 является лучшим клинически подтвержденным тестом (5-7), однако тест на основе CD203c также демонстрирует свою надежность и применяется в настоящее время (8-10). В РФ доступны диагностические наборы как с CD63, так и с CD203c, а также набор, включающий в себя оба маркера.

Особенности преаналитического этапа BAT

В качестве отрицательного контроля используется буфер PBS¹ или буфер, содержащий кальций, гепарин и ИЛ-3. Базофилы цельной крови при взаимодействии с ЭДТА², которая является хелатирующим агентом сорбирующим ионы, в том числе ионы кальция, утрачивают способность к активации. Для восстановления этой способности необходимо добавление кальция. Гепаринизированная кровь не требует этого дополнительного преаналитического этапа. Однако, использование ЭДТА в качестве антикоагулянта имеет свое объяснение – временная утрата базофилами способности к активации помогает избежать спонтанной активации базофилов на преаналитическом этапе. Наполнение пробирки кровью должно быть достаточным — не менее половины объема, для исключения повышения концентрации ЭДТА и, соответственно, искажения результата.

Транспортировка крови для теста активации базофилов стала рутинным явлением в европейских странах. Базофилы оказались более стабильны, чем считалось ранее. Общество Instand e.V., располагающееся в Германии, организует EQA тесты ( external quality assessment – внешняя оценка качества), отправляя образцы цельной крови участнику, которые он получит в течении 24 часов для проведения ВАТ.

Антигистаминные препараты не влияют на тест активации базофилов (12), но следует избегать применения стероидных гормонов (12) и циклоспорина А (13). Образцы крови для исследования предпочтительно брать в течение 1 года после последнего контакта с предполагаемым аллергеном (14,15). Оптимальным сроком для проведения исследования является интервал от 3 до 12 недель после аллергической реакции на предполагаемый аллерген, хотя специфическая базофильная реакция часто сохраняется в течение более длительного периода времени.

Для предотвращения контаминации аллергенами до и во время стимуляции аллергеном пробирки с образцами и окна в лабораторном помещении должны быть закрыты. Тест проводится с использованием ламинарного шкафа. Латексные перчатки не используются.

¹PBS (англ. Phosphate buffered saline-Натрий-фосфатный буфер) — буферный раствор, используемый в биологических исследованиях. Представляет собой водный раствор солей, содержащий хлорид натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия и дигидрофосфат калия.

Аллергены для проведения ВАТ

Для некоторых аллергенов известны стандартные концентрации – их достаточно ограниченный перечень приведен в приложении к согласительному документу EAACI по применению ВАТ в аллергологии (16). Лекарственные средства обычно разводят в 5-25 раз (2), чаще в соотношении 1:25, но некоторые 1:250. По возможности следует использовать чистые активные ингредиенты или лекарственные препараты для инъекций, вводимых внутривенно, поскольку солюбилизированные таблетки представляют собой сложные смеси активных и вспомогательных веществ (2). Некоторые препараты нестабильны и метаболизируются в растворе, поэтому аллергены должны быть приготовлены в свежем виде для каждого теста. Воздействие света является критическим фактором для результатов ВАТ при использовании фотолабильных препаратов, таких как моксифлоксацин (17). Отрицательный тест с исходным лекарственным средством не исключает реакции пациента на метаболит лекарственного средства (18). Токсичность и неспецифическую активацию следует оценивать для каждого тестируемого вещества. Белковые аллергены могут быть разбавлены до концентраций 10⁻⁵ — 10⁻¹⁵ (2).

Показатели и интерпретация

Существует два основных показателя активности базофилов: реактивность и чувствительность. Реактивность — количество базофилов, которые ответили на определенный стимул (19). Измеряется с одной или двумя концентрациями аллергена. После подтверждения реактивности может быть произведена оценка чувствительности базофилов. Чувствительность базофилов – это концентрация аллергена, при которой активируется половина всех реактивных базофилов (1). Для этого необходимо произвести измерение с 6-8 концентрациями аллергена (20). Таким образом, определение чувствительности базофилов требует значительного количества реагентов и в виду их высокой стоимости данное исследование рутинно не проводится в российских клинико-диагностических лабораториях.

При оценке выполнения теста результаты пациентов, не ответивших на стимуляции, следует относить к нонреспондерам и рассматривать, как ложноотрицательные (2). По разным данным от 5 до 15% населения являются нонреспондерами. Невозможно сделать никаких выводов относительно реакций, вызванных аллергеном, у данной группы обследуемых. Нонреспондеры могут испытывать симптомы аллергических заболеваний и иметь положительные результаты кожных проб с соответствующими аллергенами. Нонреспондеры невосприимчивы к стимуляции через FceRI в стандартных условиях BAT, это явление связано с различиями во внутриклеточных сигнальных путях (21, 22).

ВАТ в алгоритме диагностики аллергических заболеваний

В общем алгоритме диагностики аллергии, представленном в согласительном документе EAACI посвященном клиническому применению ВАТ, указывается на необходимость собрать анамнез пациента с попыткой определить источник аллергена и оценить тяжесть аллергической реакции. Аллергическая реакция должна быть подтверждена объективным тестом, в идеале в течение 1 года после последнего воздействия, вызвавшего симптомы (14,15). Тесты первой линии включают в себя определение специфического IgE в сыворотке крови, кожный прик-тест, а в отношении яда насекомых и лекарственной аллергии — внутрикожный тест. Однако, у очень небольшого числа пациентов (30 из 100 000) кожный прик-тест и интрадермальный тест могут вызвать системные реакции, если аллергическая реакция была действительно тяжелой (23,24). Измерение уровня специфического IgE может оказаться невозможным, если аллерген недоступен в качестве стандартного реагента, и может иметь ограниченную ценность в зависимости от характеристик доступных реагентов. Измерение уровня специфического IgE и положительный результат кожных проб указывают на сенсибилизацию, но не являются клинически значимыми сами по себе (2).

ВАТ в диагностике лекарственной аллергии

Диагностическое исследование гиперчувствительности к лекарственным аллергенам направлено на выявление причинно-значимого аллергена и определение безопасного альтернативного препарата. Это особенно важно при диагностике аллергии на препараты, используемые для анестезии, когда провокационное тестирование невозможно, непрактично или неэтично (2). Часть лекарственных средств невозможно использовать для определения специфических IgE, так как связывание их молекул или метаболитов в твердую фазу невозможно (25).

Патогенез не IgE-опосредованных анафилактоидных реакций изучен не до конца. Эти реакции могут быть следствием опосредованной комплиментом или прямой активации, а также гиперосмолярности, что встречается при применении рентгеноконтрастных препаратов и препаратов для общей анестезии (26,27). Эти реакции могут быть смоделированы и выявлены с помощью ВАТ.

Важно отметить, что BAT дает положительные результаты у 40% пациентов с системной реакцией в анамнезе и отрицательным результатом кожных проб, но положительным результатом провокационной пробы. Тест активации базофилов имеет хорошую прогностическую ценность отрицательного результата, полезен при принятии решения о проведении провокационного теста. ВАТ представляет высокую ценность для диагностики лекарственной гиперчувствительности к препаратам для которых отсутствуют другие in vitro тесты, а кожные пробы недоступны, ненадежны или дают неоднозначные результаты (2).

Таким образом, тест активации базофилов – это дополнительный инструмент диагностики лекарственной аллергии, который безопаснее, мягче и дешевле, чем провокационный тест, а в некоторых случаях является единственным доступным диагностическим инструментом (2).

BAT в диагностике хронической крапивницы

Хроническая спонтанная крапивница все чаще рассматривается как аутоиммунное (аутореактивное) заболевание. Проведенные за последние десятилетия исследования в области патогенеза ХСК дали основания выделить 2 эндотипа аутоиммунной крапивницы: аутоиммунная (аутоаллергическая) ХСК I типа, обусловленная наличием ауто-IgE антител к аутоантигенам, преимущественно к ТПО, ДНК и ИЛ-24; аутоиммунная ХСК типа IIb, которая характеризуется наличием ауто-IgG антител против высокоафинного IgE-рецептора FcƐRI и ауто-IgG против IgE (28).

В настоящее время единственными общедоступными методами для выявления аутоантител к IgE или аутоантител к FcƐR1 являются кожный тест с аутологичной сывороткой (ASST) и тест активации базофилов сывороткой больного крапивницей (BATs). ASST — это неспецифический скрининг-тест, который помогает оценить наличие в сыворотке крови гистамин-рилизинг факторов любого типа, а не только гистамин-рилизинг аутоантител, поэтому он используется для первого этапа диагностики аутоиммунной крапивницы. BATs определяет активацию маркеров базофилов донора в ответ на стимуляцию сывороткой крови пациентов с ХСК. Тест активации базофилов с активацией CD63 в качестве маркера активации для ХК был признан как специфическая, чувствительная и безопасная альтернатива in vitro для обнаружения функциональных аутоантител (31,32). Этот тест применяется для второго этапа диагностики аутоиммунной крапивницы, а также может помочь оценить активность заболевания у пациентов с крапивницей. В отличии от ASST при диагностике ХСК с помощью ВАТ нет необходимости прерывать лечение антигистаминными препаратами, так как они не влияют на результаты теста. Кроме того, BATs используется в качестве маркера чувствительности к циклоспорину А или омализумабу (29,30).

Основной проблемой является неоднородность результатов, так как для анализа используются базофилы цельной крови разных доноров. Одним из вариантов решения данной проблемы является титрованное добавление ИЛ-3 (31). Тест активации базофилов с аутологичными базофилами не проводят, так как пациенты с ХК часто являются нонреспондерами или слабо реагируют на перекрестное связывание IgE и нередко имеют симптоматическую базопению (33,34).

ВАТ в диагностике пищевой аллергии

Несмотря на широкое распространение кожных prick-тестов и определения специфических IgE к пищевым аллергенам и их компонентам, тест активации базофилов имеет хорошие перспективы рутинного применения для диагностики пищевой аллергии. Некоторые исследования демонстрируют более высокую точность ВАТ в сравнении с кожными тестами и определением специфических IgE к пищевым аллергенам (35-37).

Известно, что некоторые варианты пищевой аллергии при условии соблюдения строгой элиминационной диеты, со временем разрешаются. Тест активации базофилов полезен для оценки естественного разрешения пищевой аллергии и определении того момента, когда пищевой аллерген может быть безопасно повторно введен в рацион.

Представляется, что ВАТ целесообразно использовать в следующих случаях :

Источник

Оптимизация концентрации аллергенов для использования в тесте активации базофилов

*Пятилетний импакт фактор РИНЦ за 2020 г.

Читайте в новом номере

Для успешного выявления сенсибилизации к различным аллергенам (пищевым, лекарственным, ингаляционным) недавно предложены функциональные клеточные тесты. Тест активации базофилов рассматривается как провокационный тест in vitro, он показал высокую чувствительность и специфичность для большого спектра аллергенов.
Цель исследования: изучить влияние различных концентраций аллергенов на активацию базофилов in vitro у различных категорий пациентов.
Материал и методы: обследованы 5 пациентов с аллергическим бронхолегочным аспергиллезом, 9 больных атопической бронхиальной астмой без микогенной сенсибилизации, 11 пациентов с атопическим дерматитом (6 с сенсибилизацией к аллергену пшеничной муки и 5 без таковой). Лабораторное обследование включало определение уровня специфических IgE и тест активации базофилов in vitro методом проточной цитометрии с концентрациями аллергенов («Алкор Био», Россия) от 0,5 до 100 мкг/мл.
Результаты исследования: с увеличением концентрации аллергенов Aspergillus fumigatus и пшеничной муки в пробах повышалось количество активированных базофилов, ярко экспрессирующих CD203c. Показано значение выбора оптимальной концентрации аллергенов в тесте активации базофилов для исключения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов. Для повышения точности метода требуются использование невысокого индекса активации с целью увеличения чувствительности и применение невысокой, но достаточной для активации базофилов концентрации используемого аллергена для повышения специфичности. Оптимальный диапазон концентраций для обоих аллергенов при использовании в тесте активации базофилов составил 2–10 мкг/мл. Показано, что степень активации клеток при взаимодействии с грибковым аллергеном выше, чем с пищевым.
Заключение: выявление сенсибилизации пациента в тесте активации базофилов при использовании оптимальной дозы аллергена совпадает с данными анамнеза, положительным результатом кожных проб и уровнем специфических IgE к аллергенам.

Ключевые слова: аллергические заболевания, сенсибилизация, тест активации базофилов, концентрация, аллергены, IgE, аллергический бронхолегочный аспергиллез, атопический дерматит.

Для цитирования: Бычкова Н.В., Учеваткина А.Е., Козлова Я.И. и др. Оптимизация концентрации аллергенов для использования в тесте активации базофилов. РМЖ. 2019;3:32-35.

1 Nikiforov All-Russian Center for Emergency and Radiation Medicine, Saint Petersburg
2 Pavlov First St. Petersburg State Medical University
3 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint Petersburg
4 Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Cell function testing, for which an optimal conditions selection has proceeded, has been recently proposed to improve the possibility of sensibilization detection to such allergen types as food, drug, inhalation. Basophil activation test is considered as a provocation in vitro test. It showed high sensitivity and specificity to a large range of allergens.
Aim: to study an allergen concentration impact on basophil activation in vitro in different patient groups.
Patients and Methods: 5 patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis, 9 patients with atopic asthma without mycetogenic sensitization, 11 patients with atopic dermatitis (6 — with sensitization to wheat flour allergen, and 5 — without it) were examined. Laboratory examination included determination of the specific IgE level and basophil activation in vitro test by flow cytometry with allergen concentrations (Alkor Bio, Russia) from 0.5 to 100 µg/ml.
Results: the number of activated basophils expressing CD203c advanced with the allergens concentration increase in the samples. The value of choosing the optimal allergens concentration of Aspergillus fumigatus and wheat flour in the basophil activation test to exclude false positive and false negative results was demonstrated. The method accuracy improvement requires low activation index to increase sensitivity and low but sufficient allergen concentration used for the specificity increase to activate basophils. The optimal concentrations range for both allergens in the basophil activation test was from 2 to 10 µg/ml. It was shown that the cells activation degree in interaction with a mycotic allergen is higher than with food.
Conclusion: detection of patient sensitization in basophil activation test using the allergen optimal dosage coincides with the history data, skin test positive results and the level of specific IgE to allergens.

Keywords: allergic diseases, sensitization, basophil activation test, concentration, allergens, IgE, allergic bronchopulmonary aspergillosis, atopic dermatitis.
For citation: Bychkova N.V., Uchevatkina A.E., Kozlova Ya.I. et al. Allergen concentrations optimization for basophil activation test. RMJ. 2019;3:32–35.

В статье представлены результаты исследования, посвященного изучению влияния различных концентраций аллергенов на активацию базофилов in vitro у различных категорий пациентов.

Введение

Материал и методы

Результаты и обсуждение

Выводы

Только для зарегистрированных пользователей

Источник

Лейкоцитарная формула с обязательной «ручной» микроскопией мазка крови (венозная кровь) (венозная кровь) в Москве

Приём и исследование биоматериала

Когда нужно сдавать анализ Лейкоцитарная формула с обязательной «ручной» микроскопией мазка крови (венозная кровь)?

Подробное описание исследования

В лейкоцитарной формуле определяют следующие виды лейкоцитов:

Исследование по подсчету лейкоцитарной формулы в Лаборатории Гемотест проводится на автоматических гематологических анализаторах, в которых используется современная технология проточной цитофлуориметрии, кондуктометрии. Анализатор оценивает 10000 клеток в одном образце, определяя размеры, структурные, цитохимические и другие характеристики. После этого производится обязательная микроскопия окрашенного мазка крови, для определения морфологической характеристики лейкоцитарных клеток. При выявлении патологии в цитоплазме или ядре клеток, эта информация обязательно указывается в примечании к анализу. При микроскопии лейкоцитарной формулы используют окраску по Романовскому. При подсчете лейкоцитарной формулы используют лабораторные клавишные счетчики. В мазке подсчитывают 100 лейкоцитарных клеток с последующим выведением процентного, и абсолютного количества клеток, исходя из общего количества лейкоцитов.
Учитывая, что автоматический и ручной метод подсчета обладают разной погрешностью и воспроизводимостью, более диагностичным является автоматический подсчет клеток. При микроскопии происходит дифференцировка незрелых форм гранулоцитов на промиелоциты, миелоциты и метамиелоциты, указываются палочкоядерные нейтрофилы, плазматические клетки и, при обнаружении, отмечаются лимфоциты разной степени зрелости, значительная вариация размеров клеток лимфоидного ряда; полиморфизм ядер лимфоцитов; краевая базофилия и вакуолизация цитоплазмы лимфоцитов, неровный контур ядра и цитоплазмы. При визуальном дифференциальном подсчете имеются три главных источника ошибок: неравномерное распределение клеток в препарате, нераспознование клеток и наличии погрешности при повторных анализах. Данный метод сложно стандартизировать и устранить «человеческий» фактор аналитических ошибок. Преимуществом данного анализа является визуальная оценка морфологии клеток лейкоцитарного ряда врачом КЛД.

Венозная кровь считается лучшим материалом для лабораторных исследований:

Подготовка к исследованию

Кровь следует сдавать в утренние часы натощак (или в дневные/вечерние часы, спустя 4-5 часов после последнего приема пищи). За 1-2 дня до исследования исключить из рациона продукты с высоким содержанием жиров.

Согласно ГОСТ Р 53079.4-2008 показания к взятию капиллярной крови возможны у новорожденных, у пациентов с очень мелкими или труднодоступными венами, при ожогах большой площади, выраженном ожирении пациента.

Биоматериал для исследования:

Взятие капиллярной крови на исследования проводится только детям до 7 лет (по особым показаниям)!

Источник